Técnicas histológicas
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Las esterasas son un grupo de enzimas que hidrolizan esteres de ácidos carboxílicos, localizándose fundamentalmente en los lisosomas. Hay muchos tipos de esterasas distintas que actúan sobre diversos sustratos, pero cuyas actividades se solapan, ya que muchas de ellas son capaces de hidrolizar el mismo sustrato. Por ello, la subdivisión de las esterasas se basa en el tipo particular de ester que hidrolizan más eficientemente y en el efecto de diversos inhibidores enzimáticos.
La técnica utilizada en este caso revela todos los tipos de actividad esterasa ya que se emplea como sustrato un ester simple, el alpha-naftil acetato, por ello se denomina esterasa no específica. Los enzimas liberan el alpha-naftol que se revela con la sal diazoica pararrosanilina con nitrito sódico. Como en la mayor parte de las técnicas histoenzimáticas, se emplean tejidos congelados y cortes obtenidos en criostato, ya que el proceso de deshidratación e inclusión inactivaría los enzimas cuya presencia se quiere demostrar.
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| RESULTADOS: los puntos con actividad esterasa aparecen de color marrón rojizo.
Imagen: ganglio linfático de rata.
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Colorante que tiñe estructura basófilas, tales como la cromatina. Se puede comportar como colorante ortocromático (tiñe de color azul) o metacromático (tiñe de color violeta-rojo), dependiendo del pH y de la naturaleza química de la sustancia teñida.
Como colorante ortocromático, se usa frecuentemente para teñir tejido nervioso, donde tiñe la heterocromatina y los gránulos de Nissl (acúmulos de cisternas de retículo endoplásmico rugoso de los somas neuronales, así como las fibras nerviosas amielínicas y células de glía. También se utiliza para la tinción de cortes semifinos.
El azul de toluidina tiñe metacromáticamente las estructuras ricas en proteoglucanos sulfatados, como el heparán sulfato, presente - por ejemplo - en el cartílago joven (condroblastos y matriz inmadura) y en los gránulos de las células cebadas.
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RESULTADOS:Ortocromasia: las estructuras basófilas aparecen teñidas de color azul.
Imagen: Soma neuronal del asta ventral de la médula espinal de rata.
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RESULTADOS:Metacromasia. las estructuras metacromáticas aparecen teñidas de color violeta.
Imagen: CSF de filamento primario branquial de trucha arco iris.
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La inclusión de las muestras en resinas plásticas (como el Epon o la Araldita y similares) permite la obtención de cortes de grosor mucho más delgado que en el caso de la parafina. Aunque inicialmente esta técnica de inclusión se usó como un método para seleccionar regiones para la obtención de cortes ultrafinos para la microscopía electrónica de transmisión, hoy en día se utiliza frecuentemente para la microscopía la óptica, ya que se obtiene una resolución mucho mayor.
El grosor de los cortes semifinos varía entre 0,5 y 5 mm y se tiñen con diversas técnicas como el azul de toluidina o la hematoxilina-eosina. Usando resinas de bajo punto de solidificación es posible realizar también técnicas histoquímicas y de inmunomarcaje.
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| RESULTADOS: se puede apreciar la mayor resolución de la imagen.
Imagen: CSF de filamento branquial de trucha arco iris (Az. toluidina).
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Son un grupo de enzimas hidrolíticos que actúan sobre los ésteres del ácido fosfórico. Algunas fosfatasas actúan específicamente sobre un sustrato determinado, por ejemplo la adenosina trifosfatasa, pero la mayoría actúan sobre diversos sustratos y su clasificación se basa en el pH al cual presentan una actividad óptima, diferenciándose dos grupos:
Fosfatasas alcalinas que exhiben actividad óptima a pH elevado (8,3 – 9,4)
Fosfatasas ácidas que presentan actividad óptima a pH bajo (4,7 – 5,5)
Las fosfatasas ácidas se localizan fundamentalmente en los lisosomas, mientras que la localización subcelular de las fosfatasas alcalinas no está clara.
Para la demostración histoquímica de ambos grupos de fosfatasas, se utiliza como sustrato el naftol-AS-BI-fosfato al pH correspondiente. A continuación, el naftol liberado se demuestra con una sal de diazonio (Fast Red TR para la fosfatasa alcalina y pararrosanilina con nitrito sódico para la fosfatasa ácida). Tras la reacción, los núcleos se contrastan con hematoxilina. En el caso de la fosfatasa ácida, los cortes se deshidratan, se aclaran y se montan con Entellán o DPX. Sin embargo, en el caso de la fosfatasa alcalina no es posible la deshidratación, por lo que las preparaciones se montan con glicerina – gelatina.
Como en la mayor parte de las técnicas histoenzimáticas, se emplean tejidos congelados y cortes obtenidos en criostato, ya que el proceso de deshidratación e inclusión inactivaría los enzimas cuya presencia queremos demostrar.
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| RESULTADOS: Fosfatasa alcalina: las células con actividad fosfatasa alcalina aparecen en rojo.
Imagen: pronefros de trucha arco iris.
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| Fosfatasa ácida: las células con actividad fosfatasa ácida aparecen en rojo-anaranjado.
Imagen: pronefros de pez gato.
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| Técnica que utiliza la reducción de nitrato de plata, que se deposita sobre estructuras argirófilas. Puede usarse sola o en combinación con otras tinciones nucleares o citoplasmáticas. | |
| RESULTADOS: las estructuras argirófilas, como las fibras de reticulina (o reticulares) se tiñen de negro.
Imagen: ganglio linfático de rata.
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| Esta técnica utiliza dos colorantes: en primer lugar los cortes se someten a la acción de la hematoxilina, colorante básico, que se une a cualquier sustancia que tenga grupos ácidos, tales como los grupos fosfato del ADN y a las proteínas nucleares que poseen carga negativa. A continuación, los cortes se someten a la acción de la eosina, colorante débilmente ácido, que colorea a las estructuras básicas. | |
| RESULTADOS: las estructuras basófilas, como los núcleos, se tiñen de color azul con la hematoxilina, mientras que la eosina tiñe de rosa más o menos intenso estructuras acidófilas, como las fibras de colágeno.
Imagen: conducto de Wolff de trucha arco iris.
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Las técnicas inmunohistoquímicas se basan en la especificidad de la reacción antígeno-anticuerpo, que permite la identificación de una proteína (el antígeno), cuya presencia queremos demostrar, mediante su unión a un anticuerpo específico (anticuerpo primario) contra ella.
En este caso se ha utilizado el método de inmunodetección indirecta en dos etapas. En un primer paso, lo cortes se incuban con el anticuerpo primario, que se une a su antígeno específico allí donde esté presente. En un segundo paso, se aplica otro anticuerpo (anticuerpo secundario) contra el anticuerpo primario. El anticuerpo secundario está unido covalentemente (se dice que está marcado), en este caso, al enzima peroxidasa (un enzima que cataliza la formación de peróxido de hidrógeno, altamente oxidante). Finalmente, el producto de reacción de este enzima es revelado utilizando como sustrato 3,3’diaminobencidina (DAB) que al oxidarse forma un producto marrón insoluble. El segundo paso permite amplificar el resultado de la reacción, ya que varias moléculas del anticuerpo secundario marcado pueden unirse a cada molécula del anticuerpo primario. Como consecuencia, el sitio donde está localizado el antígeno presenta más moléculas del enzima y así resulta una mayor sensibilidad a la detección.
Se suelen emplear tejidos congelados y cortes obtenidos en criostato o fijaciones suaves con formol e inclusión en parafinas de bajo punto de fusión, para no desnaturalizar el antígeno. Tras la reacción enzimática los núcleos se contrastan con hematoxilina.
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| RESULTADOS: los puntos o células donde se localiza el antígeno aparecen de color marrón.
Imagen: ganglio linfático de rata.
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Este enzima pertenece al grupo de las deshidrogenasas, enzimas capaces de eliminar hidrógeno de los sustratos y transferirlo a otra sustancia aceptora. Las diaforasas son los enzimas que catalizan la deshidrogenación del NADH o del NADPH. La técnica histoenzimática utilizada demuestra la presencia de la NADP diaforasa en las mitocondrias de las fibras de músculo esquelético. Se ha utilizado tejido congelado de rata, a partir del cual se han obtenido cortes de 8 micras en criostato. El sustrato utilizado ha sido NADPH y el NADP liberado se ha revelado con la sal de tetrazolio NBT. Los cortes se montan con glicerina – gelatina.
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| RESULTADOS: mitocondrias en azul.
Imagen: músculo de rata.
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La reacción de PAS nos revela todo tipo de carbohidratos (polisacáridos, como el glucógeno, mucopolisacáridos, glucolípidos, glucoproteínas etc.). Se basa en la reacción con el reactivo de Schiff de los grupos aldehído liberados de los grupos vic-glicol presentes en los carbohidratos tras su oxidación con ácido peryódico. El reactivo de Schiff contiene fucsina básica (o pararrosanilina), que en solución ácida y en presencia de SO2 da lugar a una forma no coloreada (ácido N-sulfónico). Este reactivo reacciona con los grupos aldehído libres formando un compuesto insoluble de color púrpura. Esta técnica se utiliza sobre cortes obtenidos de tejido incluido en parafina o de tejido congelado.
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| RESULTADOS: carbohidratos en color púrpura.
Imagen: epidermis de trucha, Salmo trutta fario.
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Esta técnica sirve para detectar el hierro que se localiza en las células en forma de gránulos de hemosiderina que es insoluble, pero no detecta el hierro contenido en la ferritina que es hidrosoluble. Se utiliza sobre cortes obtenidos de tejido incluido en parafina o de tejido congelado.
La reacción de Perls se basa en la liberación de los iones férricos asociados a proteínas mediante la acción del ácido clorhídrico, a su vez, los iones férricos liberados reaccionan con el ferrocianuro potásico formando un precipitado azul verdoso de ferrocianuro férrico o azul de Prusia. Tras la reacción, los núcleos se contrastan con hematoxilina.
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| RESULTADOS: precipitados azul turquesa en los puntos donde se han liberado los iones férricos.
Imagen: bazo de rata.
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El rojo-O al aceite sirve para visualizar los lípidos en preparaciones histológicas. Bajo el nombre de lípidos se reúne un grupo heterogéneo de sustancias que agrupa a lípidos no conjugados, como los ácidos grasos y el colesterol, y a lípidos conjugados como fosfoglicéridos, esfingolípidos o glucolípidos. Debido a que los lípidos son disueltos rápidamente por el alcohol durante el proceso de deshidratación, para su visualización histológica se utilizan cortes obtenidos por congelación.
El rojo-O al aceite pertenece al grupo de los lisocromos, sustancias capaces de disolverse en los lípidos y colorearlos. Los lisocromos no son colorantes en sentido estricto, sino que se trata de sustancias coloreadas, muy solubles en lípidos, solubles también en sustancias no liposolubles, como alcoholes de baja concentración, y que no se unen a otras estructuras tisulares. Para su utilización en la técnica histológica, se disuelven a saturación en alcohol al 50% o al 70%. Los núcleos pueden contrastarse con hematoxilina. Finalmente, el montaje de la preparación debe hacerse con glicerina-gelatina.
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| RESULTADOS: las gotas lipídicas aparecen en rojo. Núcleos en azul.
Imagen: cultivo celular de bazo de trucha arco iris.
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Las coloraciones tricrómicas usan dos o más colorantes para teñir diferencialmente las diversas estructuras histológicas, según su basofilia / acidofilia o por su apetencia por un colorante específico. El método del tricrómico de Goldner (también conocido como Masson-Goldner) usa hematoxilina de Groat, y los colorantes rojo fucsina Ponçeau (xilidina Ponçeau, o Ponçeau 2R), naranja G (en solución de ácido fosfomolíbdico) y verde luz (solución acética). Fue diseñado por Masson y modificado por Goldner para distinguir las células de la matriz conjuntiva.
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RESULTADOS: estructuras basófilas (como las cromatina) de color pardo-marrón a negro, las estructuras débilmente acidófilas de rojo a naranja y las fuertemente acidófilas (como las fibras de colágeno) de azul a verde.
Imagen: glándula salival de rata.
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